发布者:IVD资讯
发布时间:2024-10-24
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哪些应用方向可优选Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase呢?
重亚硫酸氢盐转化/酶法转化的DNA扩增-甲基化研究
DNA甲基化测序是研究生物体内基因调控的重要技术手段,越来越多地应用于肿瘤早筛、诊断等技术中。全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)是甲基化检测的金标准,在WGBS文库构建过程中,样本DNA经重亚硫酸氢盐处理后,非甲基化的胞嘧啶(C)会转化为尿嘧啶(U),甲基化的C则保持不变。在后续PCR扩增中U会转变为胸腺嘧啶(T),但常规高保真酶不能以含有dUTP的DNA作为扩增模板,因此需要经过特殊改造耐受dUTP的酶,从而应用到甲基化文库构建或者定点突变等技术中。
DNA甲基化建库常用到两种建库方法,甲基化单链建库和甲基化双链建库,单链建库技术主要针对BS转化处理后的单链及损伤DNA进行最大程度的利用和转化,步骤包括甲基化转化(使未甲基化的C转化为U)、变性(双链DNA变性为单链DNA)、3’接头连接、二链合成以及文库扩增。甲基化双链建库则通常是在DNA转化之前或之后进行文库构建,涉及连接甲基化接头、经亚硫酸氢盐或酶法转化处理,再经过一步扩增即可构建针对特定测序平台的甲基化文库。这两种建库的文库扩增都需要用到Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase。
图1.双链甲基化建库文库流程
受损FFPE DNA样本的扩增-肿瘤领域
福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE) 的组织样本是世界各地病理实验室保存临床组织样本的标准方法。随着核酸测序技术的发展引起了人们对使用生物库中存储的历史FFPE样本的兴趣。然而,福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本在制备过程中会对DNA造成显著损伤,这些损伤包括:DNA分子链断裂,DNA高度片段化、核酸与蛋白质交联、胞嘧啶脱氨基,即FFPE样本中的胞嘧啶(C)可能脱氨基变成尿嘧啶(U)、氧化损伤、DNA的3'端被封闭、DNA-蛋白质交联。这些损伤会导致从FFPE样本中提取的DNA质量较差,从而影响下游应用,如PCR扩增、测序等。
为了解决这些问题,一种方法是采用修复试剂盒,如Hieff NGS® FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606),另一种方法是采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase对含有尿嘧啶的受损DNA模板中进行高保真扩增。
图2.耐U高保真聚合酶扩增受损的DNA模板
防止扩增子的气溶胶污染-病原领域
PCR技术使生命科学领域和研究手段发生了革命性的变化,与DNA克隆、DNA重组、DNA测序、RNA干扰等分子生物学技术一样,成为生物学和医学科学研究领域乃至临床疾病诊断不可缺少的工具。但是扩增产物的污染,是PCR反应中最主要的污染问题,因为PCR产物拷贝量大(一般为1013copies/ml),远远高于PCR检测拷贝的上限,所以极微量的PCR产物气溶胶,就可能造成假阳性。对于qPCR、RT-qPCR的扩增酶为Taq酶,Taq酶具有耐U的功能,常搭配UDG酶一起使用,Taq酶不具有高保真性,在一些需要保真度高的应用中Taq酶就无法胜任,如针对病原基因组的扩增测序,此时需要采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase搭配UDG酶进行防污染的高保真扩增。UDG 酶即可将反应体系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解,并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增,从而保证扩增结果的特异性,准确性。
图3.多重扩增体系中防污染原理
基于尿嘧啶切除的克隆
基于尿嘧啶切除的克隆依赖于含有重叠序列的PCR产物进行无缝组装,不需要依赖限制性内切酶和连接酶,可用于多个PCR片段的组装、核苷酸序列的修改以及定向克隆。具体操作流程为:
PCR引物5′端具有重叠序列,包含一个dU碱基,该碱基在与5′末端6- 10 nt距离处取代dT;
通过使用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase进行PCR,在目标DNA分子和克隆载体之间生成6-10个碱基的同源性片段,并且每个PCR产物的5'端被引入了一个dU;
使用Uracil-Specific Excision Reagent处理PCR片段,在每个dU位置形成单核苷酸缺口,产生适合于PCR片段定向组装的3´单链延伸;
退火延伸完成组装。
图4.基于尿嘧啶切除的克隆示意图
以上这些应用展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase在分子生物学研究中的多功能性和高效性,使其成为实验室中不可或缺的工具之一。
Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase不仅应用领域广,而且性能优异,图5中展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高扩增效率和低残留。
图5.Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高扩增效率和低残留
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